タルボットは去り、レスターがそうしようとした瞬間、エリザベスが入ってくる。二人の間に何が起こったか明らかに知っている彼女は、彼に質問し、メアリーからの手紙について尋ね、それを見せるよう要求する。レスターはしぶしぶ手紙を渡し、メアリーが従妹と会いたいと言っていると述べ、女王にそれに応じるよう懇願する。また、彼女の質問を受けて、彼はメアリーへの愛を告白する(レスターとエリザベスのデュエット: Era d'amor l'immagine /「彼女は愛の絵のような人だった」)。エリザベスはメアリーが監禁されている領地での狩猟隊に参加できると告げられ、復讐心を抱きながらも会合に応じる(カバレッタのデュエット:「私の頭上にライバルが手を差し伸べた」)。
メアリーは、仲間のアンナとともにフランスでの若い頃を振り返る(カヴァティーナ:「ああ、雲よ、そよ風に浮かぶ光よ」)。王族の狩りの音が聞こえ、女王が近くにいると叫ぶ狩人の声を聞いて、メアリーは嫌悪感をあらわにする(カバレッタ: Nella pace del mesto reposo /「私の悲しい隠遁生活の平穏の中で、彼女は私に新たな恐怖を抱かせるだろう」)。驚いたことに、レスターが近づいてきて、エリザベスがもうすぐ到着することをメアリーに警告し、女王に対して謙虚に振る舞うよう助言する。そのとき、メアリーは落胆する(デュエット: Da tutti abbandonata /「誰からも見捨てられ、私の心は希望を知らない」)。しかし、レスターはメアリーの自由を得るために必要なことは何でもすると約束し、エリザベスに会いに行くために彼女のもとを去る。そして、女王に忍耐を懇願しようとする。
メアリーがタルボットによって連れてこられると、エリザベスは敵意をもって反応し(È sempre la stessa: superba, orgogliosa / 彼女はいつも同じで、高慢で、横柄です)、各登場人物が集合的に自分の気持ちを表現した後、メアリーは女王の前に近づいてひざまずきます(アリア: Morta al mondo, ah! morta al trono / 「世にも、王位にも死んだ者よ…私はあなたの許しを請うために来ました」)。対立はすぐに敵対的になります。エリザベスはメアリーが夫のダーンリー卿を殺害しただけでなく、反逆と放蕩行為を行ったと非難し、その間ずっとレスターは双方の仲をなだめようとします。エリザベスの偽りの告発に腹を立てたメアリーは彼女を Figlia impura di Bolena (「ブーリン家の不純な娘」)[37] と呼び、最後の侮辱を続けます: Profanato è il soglio inglese, vil bastarda, dal tuo piè! (「イングランドの王位は、卑劣な奴よ、お前の足によって汚された」)。[38] エリザベスは恐怖し、衛兵にメアリーを連れ去るよう要求し、「お前を待ち受ける斧が私の復讐を示すだろう」と宣言する。メアリーは監禁状態に戻される。
第2幕
第1場: エリザベッタのアパートの一室
セシルが死刑執行令状を持って入ってきて、署名するよう説得しようとする。エリザベスが躊躇する間、エリザベスはその状況について熟考する (アリア: Quella vita a me funesta / 「あの人生は、私にとってとても脅威だ」)。セシルは彼女に署名するよう促し、「そうすれば、すべての支配者が、そのことでお前を赦免する方法を知るだろう」と告げ、彼女が署名しようとした瞬間、レスターが到着する。エリザベスは彼を見て「あなたは死刑執行を急がせている」と叫び、死刑執行令状に署名した。レスターは慈悲を懇願し、エリザベスは
メアリーは自分の運命、そしてレスターの運命についても熟考する。「私は皆に不幸をもたらした」。タルボットとセシルが入ってきて、セシルはメアリーに死刑執行令状を持っていると告げる。セシルが部屋を出た後、タルボットはレスターが処刑に立ち会うよう命じられたことをメアリーに伝える。悲しみに打ちひしがれるメアリーは、ダーンリー卿の幽霊が自分と一緒に部屋に居ると想像し、タルボットが慰めの言葉を述べる(二重唱:Quando di luce rosea il giorno a me splendea / 「夜明けの光が差し込む間、私の命はまだ輝いていた」)。しかし、タルボットは次に「もう一つの罪」についてメアリーに迫る。それは「バビントンとの一体感」(「uniti eri」)[39] である。メアリーは最初「ああ!黙ってなさい。それは致命的な過ちだった」と答えるが、タルボットがしつこく言うと、「私の心が死ぬことでそれが証明される」と付け加える。